DNA複製
DNA複製（ディーエヌエイふくせい）は、細胞分裂に先立って二本鎖DNAが複製され倍化する過程のことで、遺伝におけるもっとも根源的な現象である。生物学ではしばしば複製と略される。複製されたDNAは細胞分裂において二つの娘細胞に分配され、遺伝情報を受け継いでいく。
複製において、二本鎖DNAはその二重らせん構造をほどき、それぞれのDNA分子を鋳型として新たなDNA分子が作られ、新旧のDNA分子が対になって再び二重らせんになる。このように、一構造に二本ある親分子の一本は、必ず娘分子に受け継がれる、DNAの複製様式は半保存的複製と呼ばれる。
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[編集] 複製の機構
DNA複製とは、二重螺旋構造をしたDNA（以下、特に断りのない限り一本の直鎖DNAを指す。）が倍化することである。すなわち、複製される対象は、二重螺旋DNAで、互いに相補的な二本のDNAが無数の水素結合によって繋がっている。複製の成果も同じで、ただ数が2倍に増えている。複製される前のDNAを親鎖parent strand、複製によって新たに作られたDNAを娘鎖 daughter strand という。複製の成果を見ると、倍化した二重螺旋DNAの二本のDNAのうち、一本は親鎖のDNAで、もう一本は娘鎖である。このように、複製は親鎖の再利用と、親鎖と相補的な娘鎖の合成を経ており、このような複製の様式を半保存的複製という[1]。
複製の過程には複製開始、伸長 elongation 、成熟 maturation 、終結 termination の4段階があるといわれている[2]。実際にはこれら複製の要素的作業は同時に進行している。
[編集] 複製開始
[編集] 巻き戻し
複製開始第1段階は、親鎖の二重螺旋を二本の親鎖に分解する巻き戻しである。 巻き戻しは二重らせん構造に無数にある水素結合を切断して起こるが、全ての水素結合を一気に切断するのではない。巻き戻しは、DNA上の決まった場所（複製起点、または開始点 origin ）から最初の切断が始まり、次にその隣の水素結合が切られ、その次はその隣と順番に進行していき、特定の領域（複製終結点、または停止点 terminus ）に至ると巻き戻しは停止する。1つのDNAにある複製起点（と複製終結点）の位置と数は生物によって異なるが、（非環状DNAであろうとも）末端にはない。巻き戻しは複製起点から一方の方向にのみ進むのではなく、両方向へと進行する。1つの複製起点によって巻き戻しが及ぶ範囲を複製の単位とし、これをレプリコン replicon と呼ぶ。レプリコンは原核細胞の染色体には1つしかないが、真核細胞の場合は複数存在する。一般的な巻き戻しの機構は、先ずいくつかの因子が複製起点に誘導されることによって開始され、それらが DNA に結合して DNA を湾曲させ、さらにDNAヘリカーゼ（DNA巻き戻し酵素）が結合し、二重らせんのねじれをとるように回転させ、DNAの二本鎖が分かれた複製バブルと呼ばれる部分を作り（右上の模式図参照）、複製終結点に至ることである。複製起点は（点と書きながら）2つの配列から成る。 原核生物の場合、片方はイニシエーターの結合部位で、もう片方はAとTに富む配列（ATリッチ配列 AT rich ）である。一般に、イニシエーターの複製起点への特異的な結合は、ATリッチ配列内に局所的な二本鎖DNAの分解(融解、巻き戻しと同じ意味合いであるが、ここではDNAへリカーゼによるものと区別して用いている)を誘起する。 真核生物とウイルスの場合、巻き戻しの機構は基本的には原核生物と同じである。真核生物の複製起点はイニシエーター結合部位と、融解しやすい配列からなり、複製起点上でのイニシエーターとの複合体の形成によって近傍で二重らせん構造の融解が生じる 。
いずれにせよ、こうして生じた一本鎖DNA領域にDNAへリカーゼが結合し、巻き戻しを開始する。巻き戻しは可逆反応であるため、別れたヌクレアーゼは互いに攻撃しあい再び二重螺旋を構築しようとする。巻き戻された親鎖に一本鎖結合たんぱく質 (single-strand binding protein : SSB) が結合することにより、再会合を防ぐ。このとき、巻き戻された（かつ次のパラグラフで示す超螺旋の解消を経た）領域は、染色体にできた膨らみのように見えることから、複製バブル（複製の目 replication bubble ）という。後で説明するが、複製起点で2本での親鎖の融解と同時に、2本の娘鎖の合成が始まる。この先でさらに親鎖が巻き戻ると、これと同時に解けた親鎖に沿って複製が進行する。実際、複製は巻き戻しと同じ速度で進行する。どんな場合でも、ほどけている親鎖で伸長中の娘鎖とついになっていないものや複製中のものは、ごく短い。二重螺旋が解け複製が進行している親鎖上の部位を複製フォーク replication fork という。そのため、複製フォークとは、複製終結点にたどり着くまでの、複製バブルの両端すなわちDNAの枝分かれ部分を指す。
[編集] DNAのよじれの解消
複製開始第2段階は、DNAトポイソメラーゼ（細菌等はトポII型DNAジャイレース)による、DNAへリカーゼが二重らせんをほどく際に発生したDNAのよじれの解消である。 二重螺旋DNAは10bpごとに1巻きの螺旋（ターン）を形成しているため、10bp巻き戻すたびにDNAは縦軸を中心に1回転する。この回転は、両端の切れている直鎖状の二重螺旋ならば問題なく進行する。しかし、細菌や大多数のウイルスの二重螺旋は環状である。また、真核生物の染色体は直鎖状とはいえ巨大であり、しかも、各所で核マトリックスに結合してループ構造を形成している。このループ構造は環状構造と同じ意味合いを持つ閉鎖構造であるため、回転は困難である。 このように、自由に回転できないDNAは巻き戻しによってよじれを生じ、さらに大きな螺旋を形成する。ちょうど電気コードの両端を持って数回巻くと大きなねじれが生じるのに似ている（360度回すごとにコードは1回交差する）。このようなねじれを超螺旋（スーパーコイル super coil ）と呼ぶ。DNA螺旋は右回りであるため、複製フォークの進行方向で形成される超螺旋も右回りとなる（正の超螺旋）。正の超螺旋がたまると巻き戻しに対する抵抗が生じ、複製フォークの進行は止まってしまう。巻き戻しがスムーズに行われるためにはDNAに逆の超螺旋（不の超螺旋）を導入すればよい。
このような、DNAの高次構造の変換を担う一群の酵素をDNAトポイメラーゼという。先ほどのねじれたコードは、一方の手を放すと逆方向に回転してねじれのストレスを解消する。DNAトポイメラーゼは、巻き戻された一方のDNAを切断し、もう一方のDNAをその間隙に通過させたあとで再結合するという一連の反応を触媒する。この活性により、DNAのリンキング数 (L) は変化する。リンキング数は、1つの二重螺旋DNAのターン数 (T) と超螺旋の数 (S) の和 (L = T + S) である。たとえば4,000bpを持つ閉環状二重螺旋DNAの場合、ターン数は400個ある (L = 400 + 0) 。これを10bpだけ巻き戻すと、ターン数が1個減り、複製フォーク手前に正の超螺旋が1巻き生じる (L = 399 + |1| ) 。20bp巻き戻し、かつDNAトポイソメラーゼにより負の超螺旋を1巻き生成すると、リンキング数は減る (L = 398 + |1 - 1| = 398)。このように、正の超螺旋と負の超螺旋が隣り合うと、螺旋ではなく弛緩した輪が形成される。この弛緩構造が複製バブルである。DNAトポイソメラーゼはリンキング数を減らすことで、超螺旋の解消に務めている。
[編集] プライマーの導入
複製開始第3段階はDNAプライマーゼ primase によるプライマーの導入である。 この段階を理解するためにはDNAポリメラーゼ DNA polymerase に関する知識が必要である。DNAポリメラーゼとは、DNAまたはRNAからそれと相補的なDNAを合成する酵素である。その機能の1つは娘鎖の合成であるが、DNAポリメラーゼには限定条件が存在する。DNAポリメラーゼは親鎖のデオキシリボヌクレオチドを認識してそれと相補的なデオキシヌクレオチドを作るが、その作業は親鎖と塩基対で会合しているオリゴヌクレオチド鎖あるいはポリヌクレオチド鎖の3'末端ででしかできない。このとき、オリゴヌクレオチド鎖またはポリヌクレオチド鎖をプライマーと呼び、DNAポリメラーゼの中で特に伸長で活躍するものをレプリカーゼ replicase と呼ぶ。一度プライマーの3'末端にデオキシリボヌクレオチドを付加すれば、レプリカーゼは親鎖の3'方向に進んでいき、次々とデオキシリボヌクレオチドを付けていき、伸長を遂行する。 だが、ここで問題が2つある。ひとつはレプリカーゼに娘鎖を作らせるためには先に目標の5'側隣にプライマーを置かなければならないこと、もうひとつは複製起点から5'方向へ進んでいるへリカーゼにより巻き戻された配列では伸長を複製フォークの進行方向と逆方向に向かって進めなければならないことである。後者の問題は後の段階で解決されるが、前者の段階はこの段階でクリアされる。プライマー合成は伸長の段階を開始させるが、実際には複製起点で融解が起こるのと同時に進行している。複製起点での最初のプライマー合成は、一次転写産物を合成するのと同じRNAポリメラーゼが触媒するが、それ以降はプライマーゼと呼ばれる特別なRNAポリメラーゼが触媒する。DNA に、DNAヘリカーゼと結合したプライマーゼが10ヌクレオチド程度のプライマーRNAを作り、この短鎖RNAが部分的に分かれた各DNA鎖に結合する。このプライマーゼを基点としてDNAポリメラーゼがヌクレオチドを付加させDNA鎖の伸長が起こる。
[編集] プライマーRNAとレプリカーゼの結合
複製開始第4段階はプライマーRNAとレプリカーゼの結合である。 この結合にはエネルギーが必要で、複数のタンパク質因子が係わっている。第3段階で説明したように、DNAポリメラーゼの中でレプリカーゼと呼ばれるものだけが、複製段階で作られたプライマーにデオキシリボヌクレオチドを付加できる。レプリカーゼにより合成された娘鎖と相補的な親鎖を鋳型鎖 template strand という。ここで、DNA複製の開始段階は完了し、伸長段階が始まる。
[編集] 伸長
伸長段階はDNAポリメラーゼによる娘鎖の合成である。DNAポリメラーゼはデオキシリボースの3'位の水酸基にヌクレオチドのリン酸基を結合させることでDNAを伸長させるので、DNA鎖全体から見れば5'末端から3'末端へと一方向にしかDNAを合成できない。したがって、図の左側のように、新たに合成される二本のDNAのうち複製起点が5'末端となるDNAはどんどん伸びていくことができ、DNAポリメラーゼの移動方向すなわち、複製の伸長方向を表す矢印が左側では一本だ。このDNA鎖をリーディング鎖 (leading strand) と呼ぶ。一方、右側は複数の矢印が示されている。複製開始第3段階でも述べたが、3'末端から5'末端方向へはDNA鎖を合成することはできないので、右側のDNAについてはより複雑な過程を通らねばならない。左右の鎖について、以下に別々に説明する。
リーディング鎖は最初に合成が開始される娘鎖である。この鎖は、レプリカーゼにより5'末端から3'末端に向けて連続的に合成される。このとき、レプリカーゼは鋳型鎖上を複製起点から5'末端に向かって移動し、一度に１個ずつのデオキシリボヌクレオチドをプライマーに付加していき、リーディング鎖を合成していく。SSBは、この過程でDNAから解離する。もし、レプリカーゼが鋳型鎖の塩基と相補的でないヌクレオチドを新たに合成されたリーディング鎖に付加したとすると、誤って付加したヌクレオチドを除去する。この過程は校正 proofreading といい、間違ってた付加されたヌクレオチドと伸長中のリーディング鎖をつなぐホスホジエステル結合が切断される。この校正を進行させるレプリカーゼの活性をエキソヌクレアーゼ活性 exonuclease activity という。レプリカーゼは鋳型鎖上をジッパーのように動いていると思えばいい。
ラギング鎖はリーディング鎖に比べて合成は始めるタイミングにしてもスピードにしても遅れている。複製フォークとレプリカーゼで進行方向は逆なので、複製フォークがある程度進んだところで複製起点に引き返すことにより5'末端から3'末端へと合成を行う。いくつもの断片が不連続に合成され、その後、DNAポリメラーゼとリガーゼにより隙間が埋められるのだ。こちらのDNA鎖をラギング鎖 lagging strand と呼ぶ。また、ラギング鎖のDNA断片は岡崎フラグメント Okazaki fragment と呼ばれる。すでに述べたとおり、これらの断片の接続は、まずリボヌクレアーゼによりプライマーRNAが除去されDNAリガーゼによってつなぎ合わされる。ラギング鎖の複製様式を不連続複製 discontinuous replication という。
[編集] 成熟
複製における成熟とは、ラギング鎖合成で作られた岡崎フラグメントからプライマーを除去し、この結果できた隙間をデオキシリボヌクレオチドでふさぎ、最後に不連続合成されたDNA断片をつなぎ合わせることである。この過程はDNA鎖の伸長と共役しており、岡崎フラグメントが合成されるとすぐに始まる。
[編集] 終結
上記の過程（複製開始、伸長、成熟）はレプリコンの終わりまで続く。レプリコンの終わり、すなわち複製終結点に複製フォークがたどり着いたときに終結段階が始まり、複製は完了する。この段階でレプリソームはDNAから乖離する。レプリソーム replisome とは、複製に係わるすべてのタンパク質を含む複合体であり、これまでに挙げたタンパク質因子も含まれている。
直鎖状DNAの3'側の最末端ではプライマーがセットできないため、複製の度に短縮していく。この部分はプライマーを内在したテロメラーゼという酵素によって合成される（テロメアを参照）。
[編集] 複製に関係するタンパク質
[編集] DNAポリメラーゼ
詳細は「DNAポリメラーゼ」を参照
DNAを合成する反応を行う酵素をDNAポリメラーゼと呼ぶが、最初に発見されたDNAポリメラーゼは、DNAポリメラーゼI (pol I) である。前節で説明したとおり、DNAの複製は鋳型鎖上のヌクレオチドとの塩基対形成を基本とする相補鎖の合成である。このような反応、鋳型DNA上で4種類のdNTPを重合させるのがこの酵素であり、発見当初はDNA合成の主力であると考えられていたが、DNA鎖伸長の主力は pol I ではなく、後に発見されたDNAポリメラーゼIII (pol III) であった。 pol I はDNA合成過程で独自の役割を担っている。DNAポリメラーゼはそのほか多くの種類が存在する。
[編集] DNAリガーゼ
詳細は「DNAリガーゼ」を参照
DNA2本鎖中に、5'－末端がリン酸基 (5'-P) 、3'-末端がヒドロキシル基 (3'-OH) の状態の1本鎖切断部位（ニック）が存在するとき、この部位を認識してホスホジエステル結合により連結する酵素である。DNA複製時に、岡崎フラグメントの連結を行うほか、修復反応や組み換え反応におけるDNA鎖連結反応にも関与する。
[編集] DNAトポイソメラーゼ
詳細は「DNAトポイソメラーゼ」を参照
DNAのトポロジカルな異性体間の相互変換を促す酵素。環状DNAに本鎖の巻き数を変化させたり、連結型と鎖上型との相互変換を行うことにより、DNAのトポロジーを変化させる。トポイソメラーゼはI型とII型の2種類に分類される。I型は二本鎖の一方の鎖を一時的に切断する。一方、II型は両鎖の一時的切断を引き起こす。トポイソメラーゼI型によるDNAの弛緩の過程で、二重螺旋の非切断鎖が相補鎖上の切断点を通り抜ける。
[編集] 真核生物のDNA複製開始機構
DNA複製はDNA複製開始点から始まる。染色体上には多数の複製開始点が存在するが細胞周期一回あたり一度しか複製が開始しないように調節されており、これを複製のライセンシングと呼ぶ。複製のライセンシングの機構が破綻すると、ゲノムの一部が一度の細胞周期に2度複製されたり、また逆に複製されないなどの問題が生じるので、結果としてゲノム情報の安定性が損なわれる。
複製開始点はARSと呼ばれる。ARSには細胞周期を通じてORC（Origin Recognition Complex、オークと読む）複合体が形成されている。細胞周期のM期の終わりからG1期の初めにかけて、ORCが結合している複製開始点にMCM2-7の6つのタンパク質よりなるMCM複合体が結合する。これはpre-RC複合体と呼ばれる。MCM複合体はDNA複製が進行すると共にゲノムDNAから順次はがれてゆき、次のM期の終わりになるまで複製開始点に結合しない。これより、MCM複合体の複製開始点への結合を調節する機構が複製ライセンシングの正体であると予想される。この説を支持する証拠の一つとして、Geminin（S期にMCM複合体が複製開始点に結合しないように制御しているタンパク質の1つ）の発現を抑制するとゲノムDNAの一部が重複する事が報告されている。
出芽酵母に於いてはCDC7等のリン酸化タンパク質によって複製開始シグナルがでると、GINS複合体と呼ばれるタンパク質複合体が、ARS上のORCとMCMと結合し、複製が開始される。
また、ARSには早期に複製が開始されるものとS期の後半に複製が開始されるものとにわかれる。出芽酵母をモデルとした研究からは細胞周期のチェックポイントをつかさどるタンパク質群は、DNA障害などの異常を検知すると、後半に複製が開始されるARSからの複製開始反応をとめることで、DNA修復が終了するまで複製反応が起こるまでの時間稼ぎをおこなうことが知られている。
古細菌においては全体的にあまり研究が進んでいないが、Sulfolobus solfataricus P2（好熱クレンアーキオータ）などを用いてある程度DNA複製の研究が進められている。古細菌類は真核生物の複製酵素ホモログを多数持っており、真核生物寄りの複製機構を基本に、真正細菌的な要素が一部混合するようである。
[編集] ウイルスのDNA複製
DNAウイルスの多くは、宿主のDNA複製にかかわるタンパク質を使って複製する。ヘルペスウイルス科、アデノウイルス科、パポバウイルス科、パルボウイルス科などのDNAウイルスは核内でDNAを複製するが、天然痘ウイルスを代表とするポックスウイルス科では細胞質で複製をする
[編集] 人工的なDNA（断片）複製方法
- PCR法など
[編集] 突然変異
詳細は「突然変異」を参照
複製は極めて高い精度で行われるが、それでも
程度の確率で合成ミスが生じる。その結果、DNAの塩基置換が起こり、突然変異が起こる。このような複製ミスによる突然変異のほかに、紫外線や化学物質によってDNAが損傷し、突然変異が生じることがある。
[編集] 出典
- ローン生化学 J.David Rawn 著 長野敬、吉田賢右 監訳 1991年発行
- ゲノムの複製と分配 松影昭夫、正井久雄 編集 2002発行
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この「DNA複製」は、生物学に関連した書きかけ項目です。この記事を加筆・訂正などしてくださる協力者を求めています（プロジェクト:生命科学／Portal:生物学）。 |
