「葉圏」の版間の差分

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当初、葉圏は植物地上部の「表面」と定義されていた。このため、葉圏微生物とは、葉の表面に生息する[[エピファイト]]（外生菌）のみを示していた。現在では、葉圏微生物は植物表面のエピファイトと内部の[[エンドファイト]]（内生菌）の両方を意味する場合もある<ref name=suda2009 />。しかし、通常、エピファイトを中心とした微生物群を指す場合が多い。一般に、エンドファイトよりもエピファイトの菌数が多いためである。
当初、葉圏は植物地上部の「表面」と定義されていた。このため、葉圏微生物とは、葉の表面に生息する[[エピファイト]]（外生菌）のみを示していた。現在では、葉圏微生物は植物表面のエピファイトと内部の[[エンドファイト]]（内生菌）の両方を意味する場合もある<ref name=suda2009 />。しかし、通常、エピファイトを中心とした微生物群を指す場合が多い。一般に、エンドファイトよりもエピファイトの菌数が多いためである。

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== 研究の概況と手法 ==
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=== 概況 ===
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根圏の研究には100年以上の伝統があり、植物と微生物との相互作用について最も研究が進んでいるのは根圏の分野でである。しかし近年、葉圏への関心が高まっている。当初、葉圏微生物学者の主な関心は微生物の葉圏への定住、伝播および有害作用の機構を理解し、適切な対策を考案することであり、植物病原体についての研究であった。一方で、多数の無害な葉圏微生物が葉圏[[菌叢]]に影響を与えることが明らかとなった。そのほか、葉圏微生物を用いた[[生物的防除]]の研究も行われている<ref name=Andrews1992 /><ref name=Wahab1975 /><ref name=Leban1965 /><ref name=Leban1964 />。1983年に、[[霜害]]原因菌の''[[シュードモナス・シリンガエ|Pseudomonas syringae]]''を葉圏の[[拮抗菌]]により防除する技術がLindowらにより確立された<ref name=Lindow1983 />。また、葉圏微生物学の基礎として、葉圏微生物相がいくつかの植物で同定されている<ref name=Blakeman1977 /><ref name=Blakeman1982 /><ref name=Blackman1976 /><ref name=Chan1961 /><ref name=Dutta1981 /><ref name=Ebben1978 /><ref name=Jensen1971 /><ref name=Kroulik1955 /><ref name=Marois1995 /><ref name=Moubasher1971 /><ref name=Tamori1993 /><ref name=Moromizato2003 />。2015年には[[シロイヌナズナ]]の葉圏と根圏からおよそ8000の単離株が精製され、代表的な400株のゲノム塩基配列が解読された<ref name=Yang2015 />。

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=== 国際学会 ===
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葉圏研究の国際学会International Symposium on Phyllosphere Microbiologyは1970年の第一回以来、5年周期で開催されてきた。2015年に第十回がスイスMonte Veritàで開催された<ref name=10thSymposium />。

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=== 古典的な手法 ===
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葉圏微生物の古典的な研究手法には葉圏微生物を[[クローニング]]し、単離や観察を可能にする方法がいくつかある。leaf printingではまず、葉を[[寒天培地]]などの[[栄養培地]]に穏やかに押し付けて、取り除く。培地を[[恒温培養]]し、現れた[[コロニー]]を調べる。leaf washingでは葉を[[生理食塩水]]や[[リン酸緩衝液]]などで洗い、その洗液を寒天培地に塗布する。二つの方法はどちらも葉圏微生物を単離するためのものである。続いて[[顕微鏡]]による観察や、[[微生物学]]的・[[生化学]]的な手法による分析を行ってもよい。

=== 分子生物学的な手法 ===
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葉圏微生物の[[ゲノム]]（[[メタゲノム]]）を抽出して分析することでその[[遺伝学]]的・[[分子生物学]]的分析を行うことができる。抽出の際はまず、試料の葉を液体で洗う。洗液を[[ポリメラーゼ連鎖反応]]（PCR）にかけ、目的の[[遺伝子]]または[[DNA]]配列の数を増加させる。[[ゲル電気泳動]]により遺伝子のみを抽出する。特定の遺伝子/配列に特異的なマーカーにより精製物から目的の遺伝子/配列を検出・定量することができる。マーカーには生物種、あるいは分類群に特異的なものがあり、例えば[[16S rRNA]]マーカーは細菌などの[[原核生物]]のみを、[[18S rRNA]]マーカーは[[真菌]]などの[[真核生物]]のみを検出する<ref name="riederer"/>。

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洗液を[[質量分析法]](MS)で分析すると、葉圏微生物の[[タンパク質]]を解析することができる（[[メタプロテオソーム]]）<ref name="delmotte"/>。

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細菌や真菌[[胞子]]の懸濁液を実験室または野外で植物の葉に[[接種]]することで、その葉圏の、微生物の生息地としての特性を試験することができる。この試験は、接種された微生物がその葉圏環境および既存微生物との相互作用に対してどのような反応や生育をするかを明らかにする。特に、病原微生物や有用微生物が葉圏でどのような過程で繁殖をするか、繁殖のためにどのような条件を必要とするかがよく調査される。

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接種微生物には、特定の物理条件や化学物質に対して検出可能な化合物を産生する[[遺伝子改変]]微生物（[[バイオリポーター]]）が用いられることがある。バイオリポーターの使用は葉上での[[糖]]などの栄養素、水、またはその他特定の物質の存在量や分布の解析を可能にする。バイオリポーターが[[蛍光遺伝子]]（[[緑色蛍光タンパク質]]遺伝子（GFP遺伝子）など）や[[レポーター遺伝子]]を有する場合、その活性を容易に検出することができる<ref name="riederer"/>。


== 面積と微生物数 ==
== 面積と微生物数 ==
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=== 生存戦略 ===
=== 生存戦略 ===
葉圏は過酷な環境であるため、それを克服するため葉圏微生物は様々な遺伝子型や表現型を有する。
==== インドール酢酸の産生 ====
葉圏には[[インドール酢酸]](IAA)生産能を持つ細菌が多い<ref name=Lindow1998 />。IAAは植物の細胞壁を弛緩させ、[[多糖類]]を遊離させる<ref name=Goldberg1989 />。このため、IAA生産菌はIAAを生産して葉面に暴露し、栄養素を溶出させて獲得していると推測されている<ref name=Lindow2003 />。実際、''[[Pantoea agglomerans]]''の野生株（IAA生産株）は非生産株よりも葉面への定着能力が著しく高い<ref name=Brandl1998 />。
葉圏には[[インドール酢酸]](IAA)生産能を持つ細菌が多い<ref name=Lindow1998 />。IAAは植物の細胞壁を弛緩させ、[[多糖類]]を遊離させる<ref name=Goldberg1989 />。このため、IAA生産菌はIAAを生産して葉面に暴露し、栄養素を溶出させて獲得していると推測されている<ref name=Lindow2003 />。実際、''[[Pantoea agglomerans]]''の野生株（IAA生産株）は非生産株よりも葉面への定着能力が著しく高い<ref name=Brandl1998 />。


==== UV耐性 ====
[[色素]]の生産能を持つ微生物の割合は根圏でよりも葉圏で大きい。色素生産性の葉圏微生物は非生産性の株よりもUV耐性が高い<ref name=Sundin1999 />。UVはDNAを損傷させるため、UV耐性が葉圏での生育に重要であると考えられている。''Pseudomonas syringae''において、DNA損傷の修復機構は葉圏での生存に重要であることが確認されている<ref name=Gunasekera2006 />。
[[色素]]の生産能を持つ微生物の割合は根圏でよりも葉圏で大きい。色素生産性の葉圏微生物は非生産性の株よりもUV耐性が高い<ref name=Sundin1999 />。UVはDNAを損傷させるため、UV耐性が葉圏での生育に重要であると考えられている。色素の産生によるUVの影響の軽減とDNA損傷の修復が葉圏への適応に関わると考えられている。''Pseudomonas syringae''において、DNA損傷の修復機構は葉圏での生存に重要であることが確認されている<ref name=Gunasekera2006 />。

==== バイオフィルムの構築 ====
葉圏微生物は葉面に均一に分布しているのではなく、局所的にバイオフィルムを形成してそこに密集していることが示唆されている<ref name=suda2009 />。''Pseudomonas syringae''は単独で葉圏に存在する場合よりも、バイオフィルムを形成し密集しているほうが、[[環境ストレス]]に対する耐性が強い<ref name=Lindow2003 />。Lindowら（2003）はこの事実から、細胞密度に依存する遺伝子発現機構（[[クオラムセンシング]]）が葉圏での環境ストレス耐性に重要であることを指摘した。クオラムセンシングの誘導物質[[N-アシル-L-ホモセリンラクトン]]（AHL）の生産能の欠損変異株は野生株と比べて葉圏における乾燥耐性が低い<ref name=Dulla2005 />。

''P. syringae''を含めたAHLの産生菌、およびクオラムセンシングの[[攪乱物質]]の産生菌は葉圏で一定の割合で存在する<ref name=Dulla2005 />。このことから、葉圏微生物は互いに影響し合いながらバイオフィルムを形成している可能性がある。また、バイオフィルム中の高い細菌密度は[[遺伝子の水平伝播]]を高い頻度で引き起こしていると指摘されている<ref name=Bailey1996 />。


=== 植物との相互作用 ===
=== 植物との相互作用 ===
大部分の植物宿主は、細菌や[[真菌]]、[[古細菌]]、[[原生生物]]といった微生物のコミュニティーを提供する。多くの場合、このコミュニティーは植物に利益を与えるが、植物に病害や枯死をもたらす場合もある。しかし、植物に生息する微生物の大勢は植物の生育や機能に何の効果ももたらさない。
大部分の植物宿主は、細菌や[[真菌]]、[[古細菌]]、[[原生生物]]といった微生物のコミュニティーを提供する。多くの場合、このコミュニティーは植物に利益を与えるが、植物に病害や枯死をもたらす場合もある。しかし、植物に生息する微生物の大勢は植物の生育や機能に何の効果ももたらさない。


==== 窒素固定 ====
葉圏の微生物の生活特性の研究は2つの理由のために農業分野において非常に重要である。まず、植物の病原となる細菌や真菌の生存を理解することは、それらの拡散を制御するための新しい方法を開発するのに不可欠である。第二に、[[サルモネラ菌]]や[[大腸菌]][[O157]]:H7などの細菌で汚染された果物や野菜による[[食中毒]]の件数が近年、上昇している。特に、消費前に調理されていない新鮮な果物やサラダに当てはまる。優れた消毒戦略を開発することによって食中毒の発生を防止することは、国民の健康を保護するうえで重要である。利用可能な栄養素量の制限や強い太陽放射、利用可能な水量の不安定さがあるため、微生物にとって葉圏は厳しい環境であると考えられている<ref name=Berlec2012 /><ref name=Lindow2002 />。
葉圏から[[窒素固定菌]]は一定の確率で単離される。これまで単離された葉圏微生物は[[アゾトバクター]]属、''Beijerinkia''属、''Derxia''属、[[シュードモナス属]]、''Azotomonas''属、''Flavobacteriuem''属、''Klebsiella''属、[[バシラス属]]、[[クロストリジウム属]]、''Cyanophyceae''属、''Lichens''属などである<ref name=Ruiden1984 /><ref name=Yoshida1988 />。特に[[熱帯雨林]]では葉圏微生物による窒素固定が植物の重要な窒素供給経路であることが指摘されている<ref name=Ruinen1974 /><ref name=Salati1982 /><ref name=Silver1996 />。熱帯雨林では湿度が高くて葉圏微生物数が大きく、また、植物の生産性の高さに対して土壌中の窒素分が少ないためである。一方でAbrilら（2005）によると、熱帯雨林と比べて湿度が低い[[ステップ気候]]の森林においても、葉圏微生物による窒素固定の重要性は高い<ref name=Abril2005 />。以上の研究結果から、葉圏細菌による窒素固定は森林における普遍的な窒素供給源であることが示唆される。

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== 研究の背景と手法 ==
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=== 背景 ===
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根圏の研究には100年以上の伝統があり、植物と微生物との相互作用について最も研究が進んでいるのは根圏の分野でである。しかし近年、葉圏への関心が高まっている。当初、葉圏微生物学者の主な関心は微生物の葉圏への定住、伝播および有害作用の機構を理解し、適切な対策を考案することであり、植物病原体についての研究であった。一方で、多数の無害な葉圏微生物が葉圏[[菌叢]]に影響を与えることが明らかとなった。そのほか、葉圏微生物を用いた[[生物的防除]]の研究も行われている<ref name=Andrews1992 /><ref name=Wahab1975 /><ref name=Leban1965 /><ref name=Leban1964 />。また、葉圏微生物学の基礎として、葉圏微生物相がいくつかの植物で同定されている<ref name=Blakeman1977 /><ref name=Blakeman1982 /><ref name=Blackman1976 /><ref name=Chan1961 /><ref name=Dutta1981 /><ref name=Ebben1978 /><ref name=Jensen1971 /><ref name=Kroulik1955 /><ref name=Marois1995 /><ref name=Moubasher1971 /><ref name=Tamori1993 /><ref name=Moromizato2003 />。2015年には[[シロイヌナズナ]]の葉圏と根圏からおよそ8000の単離株が精製され、代表的な400株のゲノム塩基配列が解読された<ref name=Yang2015 />。

=== 培養法 ===
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葉圏微生物の古典的な研究手法には葉圏微生物を[[クローニング]]し、単離や観察を可能にする方法がいくつかある。leaf printingではまず、葉を[[寒天培地]]などの[[栄養培地]]に穏やかに押し付けて、取り除く。培地を[[恒温培養]]し、現れた[[コロニー]]を調べる。leaf washingでは葉を[[生理食塩水]]や[[リン酸緩衝液]]などで洗い、その洗液を寒天培地に塗布する。二つの方法はどちらも葉圏微生物を単離するためのものである。続いて[[顕微鏡]]による観察や、[[微生物学]]的・[[生化学]]的な手法による分析を行ってもよい。

=== 非培養法 ===
自然環境中の微生物の大半は、培養が困難な難培養性微生物である<ref name=Ward1990 />。土壌中においては、細菌の99%は難培養性ともいわれている<ref name=Torsvik1990 />。最初に非培養法によって葉圏細菌を調査したYangら（2001）によると、培養法では確認されなかった微生物が葉圏に多く存在する<ref name=Yang2001 />。培養法を用いずに難培養性微生物を研究する手法には、葉圏からDNAを直接抽出して分子生物学的に分析する手法が一般的である。

最も多用されるのは、供試葉を緩衝液中で[[超音波]]により洗浄し、葉から遊離した菌体を集め、DNAを抽出する方法である。この場合、DNA抽出には土壌DNA抽出法が用いられる<ref name=Yang2001 /><ref name=Lambais2006 />。

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=== 分子生物学的手法 ===
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葉圏微生物の[[ゲノム]]（[[メタゲノム]]）を分析することでその[[遺伝学]]的・[[分子生物学]]的分析を行うことができる。まず、抽出したDNAの溶液を[[ポリメラーゼ連鎖反応]]（PCR）にかけ、目的の[[遺伝子]]または[[DNA]]配列の数を増加させる。[[ゲル電気泳動]]により遺伝子のみを抽出する。特定の遺伝子/配列に特異的なマーカーにより精製物から目的の遺伝子/配列を検出・定量することができる。マーカーには生物種、あるいは分類群に特異的なものがあり、例えば[[16S rRNA]]マーカーは細菌などの[[原核生物]]のみを、[[18S rRNA]]マーカーは[[真菌]]などの[[真核生物]]のみを検出する<ref name="riederer"/>。

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洗液を[[質量分析法]](MS)で分析すると、葉圏微生物の[[タンパク質]]を解析することができる（[[メタプロテオソーム]]）<ref name="delmotte"/>。

=== 植物を用いた接種試験 ===
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細菌や真菌[[胞子]]の懸濁液を実験室または野外で植物の葉に[[接種]]することで、その葉圏の、微生物の生息地としての特性を試験することができる。この試験は、接種された微生物がその葉圏環境および既存微生物との相互作用に対してどのような反応や生育をするかを明らかにする。特に、病原微生物や有用微生物が葉圏でどのような過程で繁殖をするか、繁殖のためにどのような条件を必要とするかがよく調査される。

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接種微生物には、特定の物理条件や化学物質に対して検出可能な化合物を産生する[[遺伝子改変]]微生物（[[バイオリポーター]]）が用いられることがある。バイオリポーターの使用は葉上での[[糖]]などの栄養素、水、またはその他特定の物質の存在量や分布の解析を可能にする。バイオリポーターが[[蛍光遺伝子]]（[[緑色蛍光タンパク質]]遺伝子（GFP遺伝子）など）や[[レポーター遺伝子]]を有する場合、その活性を容易に検出することができる<ref name="riederer"/>。

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=== 国際学会 ===
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葉圏研究の国際学会International Symposium on Phyllosphere Microbiologyは1970年の第一回以来、5年周期で開催されてきた。2015年に第十回がスイスMonte Veritàで開催された<ref name=10thSymposium />。

== 研究の成果と利用 ==
=== 植物病害の防除 ===
長年、空気伝染性の葉圏病原菌の生理・生態について多くの研究がなされてきた<ref name=Brown2002 />。近年、非病原性の[[常在菌]]を生物防除剤（biological control agent：BCA）として利用する研究が行われている<ref name=Andrews1992 /><ref name=Wahab1975 /><ref name=Leban1965 /><ref name=Leban1964 />。1983年に、[[霜害]]原因菌の''[[シュードモナス・シリンガエ|Pseudomonas syringae]]''を葉圏の[[拮抗菌]]により防除する技術がLindowらにより確立された<ref name=Lindow1983 />。それ以降、葉圏における病害防除を目的とした製剤はいくつか商品化されている<ref name=Tushima2009 />。これら製剤の性能において、標的病原菌に対する拮抗能と、宿主植物に対する定着能が重要である。拮抗能のみを指標としてBCAを[[スクリーニング]]すると、効果の持続が安定せずに防除効果が十分に発揮されない場合がある<ref name=Tushima2001 />。スクリーニングした菌体の定着能を評価する方法として、Enyaら（2007）<ref name=Enya2007 />はIAA生産能、AHL生産能、および植物の[[抗生物質]][[サポニン]]に対する耐性を調査した。その結果、Enyaらは、トマトの[[灰色かび病]]に対して有望なBCA候補''[[Pantoea ananatis]]''近縁種を単離した。

=== 食品の衛生管理 ===
[[サルモネラ菌]]や[[大腸菌]][[O157]]:H7などの細菌が果物や野菜で繁殖すると毒物質を産生し、それを食べた人間に対して[[食中毒]]の原因となる。最低限の調理しかされていない生野菜や生果物の消費量増加に伴い、世界で食中毒の件数が増加している。[[リステリア属]]（''Listeria''属）といったいくつかのヒト病原体は土壌微生物である。土壌から又は雨滴などの水から直接伝播し、農作物に拡散することが考えられている<ref name=Whipps2008 />。食中毒原因菌[[クロストリジウム属]]（''Clostridium''属）は[[ススキ]]''Miscanthus sinensis''の体内で発見されており、広範な植物種の葉圏において分布することが示唆されている<ref name=Whipps2008 />。葉圏の病原菌及びその拮抗菌を研究することにより、食品の消毒戦略を開発して食中毒の発生を防止できる可能性がある<ref name=Berlec2012 /><ref name=Lindow2002 />。

=== 大気汚染物質の分解 ===
葉は空気中にさらされているため、空気中の汚染物質は葉圏面積に付着しやすく、葉圏微生物と接触しやすい。葉の表面には汚染物質の低分子[[フェノール]]化合物が大気中の10倍以上の濃度で蓄積されている<ref name=Sandhu2007 />。このフェノール化合物は葉圏の常在菌により分解されている<ref name=Sandhu2007 />。Sandhu（2009）は、葉圏細菌の汚染物質の分解は大気中の浄化に少なからず影響していること指摘している<ref name=Sandhu2009 />。


== 脚注 ==
== 脚注 ==
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<ref name=Timms2006>T. M. Timms-Wilson, K. Smalla et al.: ''Microbial Diversity in the Phyllosphere and Rhizosphere of Field Grown Crop Plants: Microbial Specialisation at the Plant Surface''. In: M. J. Bailey, A. K. Lilley et al. (Hrsg.): ''Microbial Ecology of Aerial Plant Surfaces''. CAB International, Wallingford/Oxfordshire 2006, ISBN 978-1845930615, p21–36.</ref>
<ref name=Timms2006>T. M. Timms-Wilson, K. Smalla et al.: ''Microbial Diversity in the Phyllosphere and Rhizosphere of Field Grown Crop Plants: Microbial Specialisation at the Plant Surface''. In: M. J. Bailey, A. K. Lilley et al. (Hrsg.): ''Microbial Ecology of Aerial Plant Surfaces''. CAB International, Wallingford/Oxfordshire 2006, ISBN 978-1845930615, p21–36.</ref>
<ref name=Hiltner1904>{{cite journal |author=L. Hiltner |title=Über neuere Erfahrungen und Probleme auf dem Gebiete der Bodenbakteriologie unter besonderer Berücksichtigung der Gründüngung und Brache |journal=Arbeiten der Deutschen Landwirtschaftlichen Gesellschaft |volume=98 |pages=59-78 |date=1904 }}</ref>
<ref name=Hiltner1904>{{cite journal |author=L. Hiltner |title=Über neuere Erfahrungen und Probleme auf dem Gebiete der Bodenbakteriologie unter besonderer Berücksichtigung der Gründüngung und Brache |journal=Arbeiten der Deutschen Landwirtschaftlichen Gesellschaft |volume=98 |pages=59-78 |date=1904 }}</ref>
<ref name=Whipps2008>{{cite book |author=John M. Whipps |author2=Paul Hand |author3=David A.C. Pink |author4=Gary D. Bending |title=Advances in Applied Microbiology |chapter=Chapter 7 Human Pathogens and the Phyllosphere |volume=64 |pages=183-221 |date=2008 |url=http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0065216408004073 |doi=10.1016/S0065-2164(08)00407-3}}</ref>
<ref name=Ruinen1974>{{cite journal |author=Jakoba Ruinen |title=Nitrogen fixation in the phyllosphere |journal=The biology of nitrogen fixation |volume=33 |pages=121 |date=1974 }}</ref>
<ref name=Salati1982>{{cite journal |author=E. Salati |author2=R. Sylvester-Bradley |author3=R. L. Victoria |title=Regional gains and losses of nitrogen in the Amazon basin |journal=Nitrogen Cycling in Ecosystems of Latin America and the Caribbean |volume=6 |pages=367-376 |date=1982 |url=http://link.springer.com/chapter/10.1007/978-94-009-7639-9_34 |doi=10.1007/978-94-009-7639-9_34}}</ref>
<ref name=Silver1996>{{cite journal |author=Whendee L. Silver |author2=Sandra Brown |author3=Ariel E. Lugo |title=Biodiversity and Biogeochemical Cycles |journal=Biodiversity and Ecosystem Processes in Tropical Forests |volume=122 |pages=49-67 |date=1996 |url=http://link.springer.com/chapter/10.1007/978-3-642-79755-2_4 |doi=10.1007/978-3-642-79755-2_4 }}</ref>
<ref name=Abril2005>{{cite journal |author=Adriana B. Abril |author2=Patricia A. Torres |author3=Enrique H. Bucher |title=The importance of phyllosphere microbial populations in nitrogen cycling in the Chaco semi-arid woodland |journal=Journal of tropical ecology |volume=21 |issue=01 |pages=103-107 |date=2005 |url=http://journals.cambridge.org/action/displayAbstract?fromPage=online&aid=274198&fileId=S0266467404001981 |doi=10.1017/S0266467404001981}}</ref>
<ref name=Ward1990>{{cite journal |author=, David M. Ward |author2=Roland Weller |author3=Mary M. Bateson |title=16S rRNA sequences reveal numerous uncultured microorganisms in a natural community |journal=Nature |volume=345 |issue=6270 |pages=63-65 |date=1990 |url=http://europepmc.org/abstract/med/1691827 |doi=10.1038/345063a0 |pmid=1691827 }}</ref>
<ref name=Torsvik1990>{{cite journal |author=Vigdis Torsvik |author2=Jostein Goksøyr |author3=Frida Lise Daae |title=High diversity in DNA of soil bacteria |journal=Applied and environmental microbiology |volume=56 |issue=3 |pages=782-787 |date=March 1990 |url=http://aem.asm.org/content/56/3/782.short |doi= |pmid= }}</ref>
<ref name=Yang2001>{{cite journal |author=Ching-Hong Yang |author2=David E. Crowley |author3=James Borneman |author4=Noel T. Keen |title=Microbial phyllosphere populations are more complex than previously realized |journal=Proceedings of the National Academy of Sciences |volume=98 |issue=7 |pages=3889-3894 |date=March 27 2001 |url=http://www.pnas.org/content/98/7/3889.short |doi=10.1073/pnas.051633898 |pmid= }}</ref>
<ref name=Lambais2006>{{cite journal |author=M. R. Lambais |author2=D. E. Crowley |author3=J. C. Cury |author4=R. C. Büll |author5=R. R. Rodrigues |title=Bacterial Diversity in Tree Canopies of the Atlantic Forest |journal=Science |volume=312 |issue=5782 |pages=1917 |date=2006 |url=http://science.sciencemag.org/content/312/5782/1917.short |doi=10.1126/science.1124696}}</ref>
<ref name=Yoshida1988>{{cite journal |author=吉田重方 |title=草地における生物窒素固定 |journal=日本草地学会誌 |volume=34 |issue=1 |pages=20-28 |date=1988 |url=http://ci.nii.ac.jp/naid/110006408267 |naid=110006408267 |ncid=AN00194108 }}</ref>
<ref name=Ruiden1984>{{cite book |editor=W. D. P. Stewart |title=Nitrogen Fixation by Free-Living Micro-Organisms |chapter= |author=J. Ruiden |publisher=Cambridge Univ. Press |year=1974 |location=ロンドン |pages=85 |url= |isbn=}}</ref>
<ref name=Last1955>{{cite journal|last=Last|first=F.T.|title=Seasonal incidence of Sporobolomyces on cereal leaves|journal=Trans Br Mycol Soc|year=1955|volume=38|pages=221–239|doi=10.1016/s0007-1536(55)80069-1}}</ref>
<ref name=Last1955>{{cite journal|last=Last|first=F.T.|title=Seasonal incidence of Sporobolomyces on cereal leaves|journal=Trans Br Mycol Soc|year=1955|volume=38|pages=221–239|doi=10.1016/s0007-1536(55)80069-1}}</ref>
<ref name=Ruinen1956>{{cite journal|last=Ruinen|first=J.|title=Occurrence of Beijerinckia species in the phyllosphere.|journal=Nature|year=1956|volume=178|pages=220–221|doi=10.1038/177220a0}}</ref>
<ref name=Ruinen1956>{{cite journal|last=Ruinen|first=J.|title=Occurrence of Beijerinckia species in the phyllosphere.|journal=Nature|year=1956|volume=178|pages=220–221|doi=10.1038/177220a0}}</ref>
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<ref name=Sundin1999>{{cite journal |author=G. W. Sundin |author2=J. L. Jacobs |title=Ultraviolet Radiation (UVR) Sensitivity Analysis and UVR Survival Strategies of a Bacterial Community from the Phyllosphere of Field-Grown Peanut (''Arachis hypogeae'' L.) |journal=Microbial Ecology |volume=38 |issue=1 |pages=27-38 |date=July 1999 |url= |doi=10.1007/s002489900152}}</ref>
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2016年7月31日 (日) 13:19時点における版

葉圏（ようけん、phyllosphere）とは微生物学の専門用語の一つであり、微生物の生息地としての、植物における地面から上の部位全体である[1][2]。

意味

葉圏とは、植物の地上部で、かつ微生物の生息域である空間である[3]。したがって、葉圏は葉と葉鞘に限定されず、芽や茎、花、果実を含む[4]。このため、caulosphere (茎)、phylloplane (葉面), anthosphere (花)およびcarposphere (果実)に細分化される。一方、微生物の生息地である、地面から下の植物部位には根圏（rhizosphere）とlaimosphereがある。根圏は根での、laimosphereは茎の地下部での周囲の土壌空間である。

葉圏という語は、根圏に対する語として1950年代半ばに造られた[5][6]。根圏は1904年にHiltnerによって定義された[7]。葉圏は1955年にLastが[1]、その翌年にRuinenが[2]用い始めた。葉圏の英語phyllosphereの由来は古代ギリシャ語のφύλλον（葉）とσφαῖρα（球）であった[8]。

当初、葉圏は植物地上部の「表面」と定義されていた。このため、葉圏微生物とは、葉の表面に生息するエピファイト（外生菌）のみを示していた。現在では、葉圏微生物は植物表面のエピファイトと内部のエンドファイト（内生菌）の両方を意味する場合もある[3]。しかし、通常、エピファイトを中心とした微生物群を指す場合が多い。一般に、エンドファイトよりもエピファイトの菌数が多いためである。

面積と微生物数

衛星データによると、地上の総葉面積は地球表面の約125％〜200％であり、推定約6億4000万〜10億km2である[9][10]。そこに生息する微生物数は、地球規模で炭素循環と窒素循環を左右するのに十分なほど大きい[11]。通常、植物の葉1cm2当たりの細菌数は百万〜千万匹である。柑橘類や針葉樹など一部の植物では1cm2当たり1,000未満であり、著しく少ない[11]。これらの情報から控えめに見積もって、地球全体での葉圏の総細菌数は1026個以上である。

環境特性

葉上で有機物は微生物細胞に吸収されて別の化合物として再び葉上に放出されるため、葉圏の環境と物質移動は基本的に変化しない。葉圏は微生物にとって「砂漠のような環境」と表現されるほど過酷である[12]。

  • 葉の表面は疎水性のエピクチクラワックスで覆われており、細菌が利用可能な栄養素や水分に乏しい。
  • 大気由来の花粉や窒素化合物および虫由来の甘露は栄養源となる。
  • 圏微生物が利用可能な水分が頻繁かつ急速に変化する。これは、雨や霧などの天候および露から水分が供給されるためであり、かつ、水分濃度は葉の表面構造や湿潤性に大きく依存するためである。
  • 気候や気温の影響を直接受けるため、温度が短いスパンで劇的に変化する。
  • 有害な紫外線に頻繁かつ長時間さらされている。

葉の表面の環境特性は局所や時期で異なる。気孔、毛茸、表皮細胞では地形や保水性、植物の分泌物が異なる。葉圏微生物は通常、葉のクチクラ層で生息する。この場所は非常に複雑な三次元結晶構造を有し、植物の生長に従いその構造を変化させる[11][13]。したがって、葉圏微生物の遺伝子型や表現型は多種多様である。

葉圏微生物

葉圏には細菌や酵母、糸状菌、真菌、植物ウイルス、古細菌、粘菌、緑藻類、コケ、地衣類、シダ、原生動物などが生息する。葉圏微生物で最もバイオマス量が大きいのは細菌である。その存在量は、培養可能な細菌だけでも一般的な植物の葉の表面積1cm当たり106～107cellsに及ぶ[14]。葉圏の細菌群は多様であり、植物病原菌（氷核活性細菌を含む）、拮抗菌、植物ホルモン産生菌、フェノール分解菌、窒素固定菌などを含む[15][16][17][18][19]。これら細菌群の分布と細胞数は植物の健康や生態系での物質循環に重要であると考えられている。

生存戦略

葉圏は過酷な環境であるため、それを克服するため葉圏微生物は様々な遺伝子型や表現型を有する。

インドール酢酸の産生

葉圏にはインドール酢酸(IAA)生産能を持つ細菌が多い[20]。IAAは植物の細胞壁を弛緩させ、多糖類を遊離させる[21]。このため、IAA生産菌はIAAを生産して葉面に暴露し、栄養素を溶出させて獲得していると推測されている[14]。実際、Pantoea agglomeransの野生株（IAA生産株）は非生産株よりも葉面への定着能力が著しく高い[22]。

UV耐性

色素の生産能を持つ微生物の割合は根圏でよりも葉圏で大きい。色素生産性の葉圏微生物は非生産性の株よりもUV耐性が高い[23]。UVはDNAを損傷させるため、UV耐性が葉圏での生育に重要であると考えられている。色素の産生によるUVの影響の軽減とDNA損傷の修復が葉圏への適応に関わると考えられている。Pseudomonas syringaeにおいて、DNA損傷の修復機構は葉圏での生存に重要であることが確認されている[24]。

バイオフィルムの構築

葉圏微生物は葉面に均一に分布しているのではなく、局所的にバイオフィルムを形成してそこに密集していることが示唆されている[3]。Pseudomonas syringaeは単独で葉圏に存在する場合よりも、バイオフィルムを形成し密集しているほうが、環境ストレスに対する耐性が強い[14]。Lindowら（2003）はこの事実から、細胞密度に依存する遺伝子発現機構（クオラムセンシング）が葉圏での環境ストレス耐性に重要であることを指摘した。クオラムセンシングの誘導物質N-アシル-L-ホモセリンラクトン（AHL）の生産能の欠損変異株は野生株と比べて葉圏における乾燥耐性が低い[25]。

P. syringaeを含めたAHLの産生菌、およびクオラムセンシングの攪乱物質の産生菌は葉圏で一定の割合で存在する[25]。このことから、葉圏微生物は互いに影響し合いながらバイオフィルムを形成している可能性がある。また、バイオフィルム中の高い細菌密度は遺伝子の水平伝播を高い頻度で引き起こしていると指摘されている[26]。

植物との相互作用

大部分の植物宿主は、細菌や真菌、古細菌、原生生物といった微生物のコミュニティーを提供する。多くの場合、このコミュニティーは植物に利益を与えるが、植物に病害や枯死をもたらす場合もある。しかし、植物に生息する微生物の大勢は植物の生育や機能に何の効果ももたらさない。

窒素固定

葉圏から窒素固定菌は一定の確率で単離される。これまで単離された葉圏微生物はアゾトバクター属、Beijerinkia属、Derxia属、シュードモナス属、Azotomonas属、Flavobacteriuem属、Klebsiella属、バシラス属、クロストリジウム属、Cyanophyceae属、Lichens属などである[27][28]。特に熱帯雨林では葉圏微生物による窒素固定が植物の重要な窒素供給経路であることが指摘されている[29][30][31]。熱帯雨林では湿度が高くて葉圏微生物数が大きく、また、植物の生産性の高さに対して土壌中の窒素分が少ないためである。一方でAbrilら（2005）によると、熱帯雨林と比べて湿度が低いステップ気候の森林においても、葉圏微生物による窒素固定の重要性は高い[32]。以上の研究結果から、葉圏細菌による窒素固定は森林における普遍的な窒素供給源であることが示唆される。

研究の背景と手法

背景

根圏の研究には100年以上の伝統があり、植物と微生物との相互作用について最も研究が進んでいるのは根圏の分野でである。しかし近年、葉圏への関心が高まっている。当初、葉圏微生物学者の主な関心は微生物の葉圏への定住、伝播および有害作用の機構を理解し、適切な対策を考案することであり、植物病原体についての研究であった。一方で、多数の無害な葉圏微生物が葉圏菌叢に影響を与えることが明らかとなった。そのほか、葉圏微生物を用いた生物的防除の研究も行われている[33][34][35][36]。また、葉圏微生物学の基礎として、葉圏微生物相がいくつかの植物で同定されている[37][38][39][40][41][42][43][44][45][46][47][48]。2015年にはシロイヌナズナの葉圏と根圏からおよそ8000の単離株が精製され、代表的な400株のゲノム塩基配列が解読された[49]。

培養法

葉圏微生物の古典的な研究手法には葉圏微生物をクローニングし、単離や観察を可能にする方法がいくつかある。leaf printingではまず、葉を寒天培地などの栄養培地に穏やかに押し付けて、取り除く。培地を恒温培養し、現れたコロニーを調べる。leaf washingでは葉を生理食塩水やリン酸緩衝液などで洗い、その洗液を寒天培地に塗布する。二つの方法はどちらも葉圏微生物を単離するためのものである。続いて顕微鏡による観察や、微生物学的・生化学的な手法による分析を行ってもよい。

非培養法

自然環境中の微生物の大半は、培養が困難な難培養性微生物である[50]。土壌中においては、細菌の99%は難培養性ともいわれている[51]。最初に非培養法によって葉圏細菌を調査したYangら（2001）によると、培養法では確認されなかった微生物が葉圏に多く存在する[52]。培養法を用いずに難培養性微生物を研究する手法には、葉圏からDNAを直接抽出して分子生物学的に分析する手法が一般的である。

最も多用されるのは、供試葉を緩衝液中で超音波により洗浄し、葉から遊離した菌体を集め、DNAを抽出する方法である。この場合、DNA抽出には土壌DNA抽出法が用いられる[52][53]。

分子生物学的手法

葉圏微生物のゲノム（メタゲノム）を分析することでその遺伝学的・分子生物学的分析を行うことができる。まず、抽出したDNAの溶液をポリメラーゼ連鎖反応（PCR）にかけ、目的の遺伝子またはDNA配列の数を増加させる。ゲル電気泳動により遺伝子のみを抽出する。特定の遺伝子/配列に特異的なマーカーにより精製物から目的の遺伝子/配列を検出・定量することができる。マーカーには生物種、あるいは分類群に特異的なものがあり、例えば16S rRNAマーカーは細菌などの原核生物のみを、18S rRNAマーカーは真菌などの真核生物のみを検出する[54]。

洗液を質量分析法(MS)で分析すると、葉圏微生物のタンパク質を解析することができる（メタプロテオソーム）[10]。

植物を用いた接種試験

細菌や真菌胞子の懸濁液を実験室または野外で植物の葉に接種することで、その葉圏の、微生物の生息地としての特性を試験することができる。この試験は、接種された微生物がその葉圏環境および既存微生物との相互作用に対してどのような反応や生育をするかを明らかにする。特に、病原微生物や有用微生物が葉圏でどのような過程で繁殖をするか、繁殖のためにどのような条件を必要とするかがよく調査される。

接種微生物には、特定の物理条件や化学物質に対して検出可能な化合物を産生する遺伝子改変微生物（バイオリポーター）が用いられることがある。バイオリポーターの使用は葉上での糖などの栄養素、水、またはその他特定の物質の存在量や分布の解析を可能にする。バイオリポーターが蛍光遺伝子（緑色蛍光タンパク質遺伝子（GFP遺伝子）など）やレポーター遺伝子を有する場合、その活性を容易に検出することができる[54]。

国際学会

葉圏研究の国際学会International Symposium on Phyllosphere Microbiologyは1970年の第一回以来、5年周期で開催されてきた。2015年に第十回がスイスMonte Veritàで開催された[55]。

研究の成果と利用

植物病害の防除

長年、空気伝染性の葉圏病原菌の生理・生態について多くの研究がなされてきた[56]。近年、非病原性の常在菌を生物防除剤（biological control agent：BCA）として利用する研究が行われている[33][34][35][36]。1983年に、霜害原因菌のPseudomonas syringaeを葉圏の拮抗菌により防除する技術がLindowらにより確立された[57]。それ以降、葉圏における病害防除を目的とした製剤はいくつか商品化されている[58]。これら製剤の性能において、標的病原菌に対する拮抗能と、宿主植物に対する定着能が重要である。拮抗能のみを指標としてBCAをスクリーニングすると、効果の持続が安定せずに防除効果が十分に発揮されない場合がある[59]。スクリーニングした菌体の定着能を評価する方法として、Enyaら（2007）[16]はIAA生産能、AHL生産能、および植物の抗生物質サポニンに対する耐性を調査した。その結果、Enyaらは、トマトの灰色かび病に対して有望なBCA候補Pantoea ananatis近縁種を単離した。

食品の衛生管理

サルモネラ菌や大腸菌O157:H7などの細菌が果物や野菜で繁殖すると毒物質を産生し、それを食べた人間に対して食中毒の原因となる。最低限の調理しかされていない生野菜や生果物の消費量増加に伴い、世界で食中毒の件数が増加している。リステリア属（Listeria属）といったいくつかのヒト病原体は土壌微生物である。土壌から又は雨滴などの水から直接伝播し、農作物に拡散することが考えられている[60]。食中毒原因菌クロストリジウム属（Clostridium属）はススキMiscanthus sinensisの体内で発見されており、広範な植物種の葉圏において分布することが示唆されている[60]。葉圏の病原菌及びその拮抗菌を研究することにより、食品の消毒戦略を開発して食中毒の発生を防止できる可能性がある[61][62]。

大気汚染物質の分解

葉は空気中にさらされているため、空気中の汚染物質は葉圏面積に付着しやすく、葉圏微生物と接触しやすい。葉の表面には汚染物質の低分子フェノール化合物が大気中の10倍以上の濃度で蓄積されている[63]。このフェノール化合物は葉圏の常在菌により分解されている[63]。Sandhu（2009）は、葉圏細菌の汚染物質の分解は大気中の浄化に少なからず影響していること指摘している[19]。

脚注

  1. ^ a b Last, F.T. (1955). “Seasonal incidence of Sporobolomyces on cereal leaves”. Trans Br Mycol Soc 38: 221–239. doi:10.1016/s0007-1536(55)80069-1. 
  2. ^ a b Ruinen, J. (1956). “Occurrence of Beijerinckia species in the phyllosphere.”. Nature 178: 220–221. doi:10.1038/177220a0. 
  3. ^ a b c 須田 亙（スダ ワタル）; 宍戸（シシド） 雅宏 (2009). “植物葉圏における細菌群集の解析”. 土と微生物 63 (2): 93-99. NAID 110009468643. http://ci.nii.ac.jp/naid/110009468643. 
  4. ^ T. M. Timms-Wilson, K. Smalla et al.: Microbial Diversity in the Phyllosphere and Rhizosphere of Field Grown Crop Plants: Microbial Specialisation at the Plant Surface. In: M. J. Bailey, A. K. Lilley et al. (Hrsg.): Microbial Ecology of Aerial Plant Surfaces. CAB International, Wallingford/Oxfordshire 2006, ISBN 978-1845930615, p21–36.
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外部リンク

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