CRISPR

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CRISPR.

CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat; クリスパー)は数十塩基対の短い反復配列を含み、原核生物における一種の獲得免疫系として働く座位である。配列決定された原核生物のうち真正細菌の4割と古細菌の9割に見出されており[1][2]、プラスミドやファージといった外来の遺伝性因子に対する抵抗性に寄与している[3][4] 。

歴史[編集]

今日CRISPRと呼ばれている反復クラスターは、石野良純（英語：Yoshizumi Ishino）らによって1987年に大腸菌で初めて記載された[5]。2000年になって、類似の反復クラスターがその他の真正細菌や古細菌で見つけられ、この時はShort Regularly Spaced Repeats (SRSR)と名付けられたが[6]、2002年にCRISPRと命名された[7]。またCRISPRリピート近傍にはヌクレアーゼやヘリカーゼをコードするCRISPR-associated (cas)遺伝子群が存在することが示された[7]。

構造[編集]

CRISPR座位の概略図。グレーの四角がリピート、カラーの棒がスペーサーを示している。

大抵のCRISPR座位には、cas遺伝子群、先行配列、リピート・スペーサー列の3要素が存在している。しかしその順序はここに示したとおりとは限らない[8][9]。

リピートとスペーサー[編集]

CRISPRリピートの要素は24から48塩基対で[10]通常はパリンドローム（回文構造）にならない二回転対称性の配列であり、したがってstem-loopヘアピン構造を形成することが想起される[11]。このリピート要素の間に似たような長さのスペーサーが介在している[10]。スペーサーの配列はプラスミドやファージの持つ配列と同一であったり[12][13][14]、あるいは自身のゲノム中の配列と同一(self-targeting spacers)であったりする[15]。ファージが感染すると、速やかに新たなスペーサーが追加される[16]。

cas遺伝子群[編集]

CRISPR associated protein
PDB 1wj9 EBI.jpg
crystal structure of a crispr-associated protein from thermus thermophilus
識別子
略号 CRISPR_assoc
Pfam PF08798
Pfam clan CL0362
InterPro IPR010179
CDD cd09727

cas遺伝子群（CRISPR関連遺伝子群）は、リピート・スペーサー列の近傍に見出されることの多い遺伝子群で、これまでに40以上のファミリーが見出されている[10]。なかでもCas1ファミリーはCRISPR/Casシステムに共通しているようである。cas遺伝子やリピート構造の組み合わせにより8種のサブタイプ(Ecoli, Ypest, Nmeni, Dvulg, Tneap, Hmari, Apern, Mtube)が定義されており、なかにはさらにrepeat-associated mysterious proteins (RAMPs)とよばれる追加の要素が見出されているサブタイプもある[10]。また1種のゲノム中に複数のCRISPRサブタイプが存在する例もある。

メカニズム[編集]

CRISPRシステムのメカニズムの概要[8]

外来DNAはcas遺伝子群のいずれかにコードされているタンパク質によって30塩基対ほどの長さに分断され、それがCRISPR座位に何らかの方法で挿入されることで免疫記憶として機能する[9]。CRISPR座位は普段からRNAが転写されており、Casタンパク質によって各々外来配列を含む小さなRNA (crRNA) に分断されている。このRNAは、別のCasタンパク質を外来DNA（またはそれに由来するRNA）に導き、真核生物のRNAiに類似した機構でその機能を抑制する[8][17]。真核生物のRNAiと原核生物のCRIPSPR/CasシステムはどちらもRNAによる外来遺伝子の抑制機構であるが、反応に関わる酵素機構や二本鎖RNAの開裂の有無、塩基長などから明確に区別される[8]。

サブタイプによって機能的にも多様化していると考えられている。EcoliサブタイプのCasタンパク質群はCascadeとよばれる複合体を形成し、RNA産物をスペーサーとリピートからなる単位へ分断して複合体に取り込む[18]。Pyrococcus属ではエンドリボヌクレアーゼであるCas6がRNAを分断している[8]。大腸菌において、CRISPRによるファージの不活化にはCascadeとCas3が必要であるが、Cas1とCas2は必要でない。

このように、CRISPR/Casシステムは外来遺伝子に対する免疫機構として研究されてきたが、前述の通りCRISPRの中には自己の配列を標的としたスペーサーが存在していることも明らかになっている。この自己標的型のCRISPRは自己免疫反応に関わると推測されてきたが[15]、野兎病菌の別種であるFrancisella novicidaのCas9が小型CRISPR関連RNA (smal CRISPR-associated RNA; scaRNA)と名付けられた小型のRNAと共に複合体を形成し、内在性の遺伝子発現を調節しているという報告もあり、自己標的型のCRISPRが内在性の遺伝子調節に関与している可能性も指摘されている[19]。

進化[編集]

CRISPRサブタイプは原核生物の系統上で混在しているので、このシステムは水平転移によって伝播してきたものと考えられる。

CRISPR/Casシステムにより、原核生物は特定のファージにたいする免疫を獲得し、ファージの伝播を阻止することができる。この免疫はその後遺伝していくので、これはラマルク進化であると唱える研究者もいる[20]。

応用[編集]

CRISPR/Casシステムの応用として以下のようなものが提唱されている。[21]

  • 発酵に利用するなど産業的に重要な細菌に対して人為的に改変したCRISPR座位を導入し、有害なファージに対する免疫を与える
  • CRISPR/Casシステムを用いた細胞および個体レベルでのRNA誘導性 (RNA-guided) のゲノム工学 (genome engineering) [注 1]技術への応用。この分野において in vivo, in vitro それぞれの系で実証実験がなされている[23] [24] [25]。
  • 内在性の遺伝子に対応するスペーサーを含むCRISPR座位を導入し、その遺伝子発現をノックダウンする
  • CRISPRのスペーサー配列を比較することによって菌株の分別を行う

脚注[編集]

注釈[編集]

  1. ^ ゲノム編集技術のこと。従来の遺伝子改変生物の作製法はランダムな変異によるものや、ES細胞の相同組換えによる標的遺伝子の改変に限られており、いずれも効率の低い方法であった。近年のZFNやTALENなどの人工制限酵素の開発により、ゲノム上の標的遺伝子の改変が容易になりつつある[22]。en:genome engineering参照。

参考文献[編集]

  1. ^ 71/79 Archaea, 463/1008 Bacteria CRISPRdb, Date: 19.6.2010
  2. ^ Grissa I, Vergnaud G, Pourcel C (2007). “The CRISPRdb database and tools to display CRISPRs and to generate dictionaries of spacers and repeats”. BMC Bioinformatics 8: 172. doi:10.1186/1471-2105-8-172. PMC 1892036. PMID 17521438. http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?tool=pmcentrez&artid=1892036. 
  3. ^ Barrangou R, Fremaux C, Deveau H, et al. (March 2007). “CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes”. Science 315 (5819): 1709–12. doi:10.1126/science.1138140. PMID 17379808. 
  4. ^ Marraffini LA, Sontheimer EJ (December 2008). “CRISPR Interference Limits Horizontal Gene Transfer in Staphylococci by Targeting DNA”. Science 322 (5909): 1843–5. doi:10.1126/science.1165771. PMC 2695655. PMID 19095942. http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?tool=pmcentrez&artid=2695655. 
  5. ^ Ishino Y, Shinagawa H, Makino K, Amemura M, Nakata A (1987). “Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product”. J Bacteriol 169 (12): 5429–33. PMC 213968. PMID 3316184. http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?tool=pmcentrez&artid=213968. 
  6. ^ Mojica FJM, Díez-Villaseñor C, Soria E, Juez G (2000). “Biological significance of a family of regularly spaced repeats in the genomes of Archaea, Bacteria and mitochondria”. Mol Microbiol 36 (1): 244–6. doi:10.1046/j.1365-2958.2000.01838.x. PMID 10760181. 
  7. ^ a b Jansen R, Embden JD, Gaastra W, Schouls LM (2002). “Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes”. Mol Microbiol 43 (6): 1565–75. doi:10.1046/j.1365-2958.2002.02839.x. PMID 11952905. 
  8. ^ a b c d e Horvath P, Barrangou R (January 2010). “CRISPR/Cas, the immune system of bacteria and archaea”. Science 327 (5962): 167–70. doi:10.1126/science.1179555. PMID 20056882. 
  9. ^ a b Marraffini LA, Sontheimer EJ (February 2010). “CRISPR interference: RNA-directed adaptive immunity in bacteria and archaea”. Nat Rev Genet 11 (3): 181–190. doi:10.1038/nrg2749. PMC 2928866. PMID 20125085. http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?tool=pmcentrez&artid=2928866. 
  10. ^ a b c d Haft DH, Selengut J, Mongodin EF, Nelson KE (2005). “A Guild of 45 CRISPR-Associated (Cas) Protein Families and Multiple CRISPR/Cas Subtypes Exist in Prokaryotic Genomes”. PLoS Comput Biol. 1 (6): e60. doi:10.1371/journal.pcbi.0010060. PMC 1282333. PMID 16292354. http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?tool=pmcentrez&artid=1282333. 
  11. ^ Kunin V, Sorek R, Hugenholtz P (2007). “Evolutionary conservation of sequence and secondary structures in CRISPR repeats”. Genome Biol 8 (4): R61. doi:10.1186/gb-2007-8-4-r61. PMC 1896005. PMID 17442114. http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?tool=pmcentrez&artid=1896005. 
  12. ^ Mojica FJ, Díez-Villaseñor C, García-Martínez J, Soria E (February 2005). “Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements”. J. Mol. Evol. 60 (2): 174–82. doi:10.1007/s00239-004-0046-3. PMID 15791728. 
  13. ^ Bolotin A, Quinquis B, Sorokin A, Ehrlich SD (August 2005). “Clustered regularly interspaced short palindrome repeats (CRISPRs) have spacers of extrachromosomal origin”. Microbiology (Reading, Engl.) 151 (Pt 8): 2551–61. doi:10.1099/mic.0.28048-0. PMID 16079334. 
  14. ^ Pourcel C, Salvignol G, Vergnaud G (2005). “CRISPR elements in Yersinia pestis acquire new repeats by preferential uptake of bacteriophage DNA, and provide additional tools for evolutionary studies”. Microbiology 151 (Pt 3): 653–63. doi:10.1099/mic.0.27437-0. PMID 15758212. 
  15. ^ a b Stern A, Keren L, Wurtzel O, Amitai G, Sorek R (August 2010). “Self-targeting by CRISPR: gene regulation or autoimmunity?”. Trends Genet. 26 (8): 335–40. doi:10.1016/j.tig.2010.05.008. PMC 2910793. PMID 20598393. http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?tool=pmcentrez&artid=2910793. 
  16. ^ Tyson GW, Banfield JF (January 2008). “Rapidly evolving CRISPRs implicated in acquired resistance of microorganisms to viruses”. Environ. Microbiol. 10 (1): 200–7. doi:10.1111/j.1462-2920.2007.01444.x. PMID 17894817. 
  17. ^ Makarova KS, Grishin NV, Shabalina SA, Wolf YI, Koonin EV (2006). “A putative RNA-interference-based immune system in prokaryotes: computational analysis of the predicted enzymatic machinery, functional analogies with eukaryotic RNAi, and hypothetical mechanisms of action”. Biol Direct 1: 7. doi:10.1186/1745-6150-1-7. PMC 1462988. PMID 16545108. http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?tool=pmcentrez&artid=1462988. 
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  24. ^ Cong, Le; Ran FA, Cox D, Lin S, Barretto R, Habib N, Hsu PD, Wu X, Jiang W, Marraffini LA, Zhang F. (2013). “Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.”. Science. PMID 23287718. 
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外部リンク[編集]

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