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ウイルスベクターは、分子生物学研究において遺伝物質を細胞に送達するために一般的に使用されるツールであり、生体内（in vivo）または細胞培養（in vitro）で利用できる。ウイルスは、感染した細胞内でゲノムを効率的に輸送するために、特殊な分子メカニズムを進化させてきた。ベクターによる遺伝子や他の遺伝物質の運搬は形質導入と呼ばれ、形質導入された細胞は形質転換体と呼ばれる。1970年代からこの機構は分子生物学において利用され始めた。ポールバーグは、バクテリオファージ<span typeof="mw:Entity" id="mwFw">λ</span>由来のDNAを含む改変SV40ウイルスを培養しているサルの腎臓細胞に感染させた[1]。

分子生物学研究での使用に加えて、ウイルスベクターは遺伝子治療やワクチンの開発に使用されている。

ウイルスベクターの共通性質

ウイルスベクターは用途に合うように改変されているが、一般的にいくつかの重要な性質を共通して持つ。

  • 安全性：ウイルスベクターは病原性ウイルスから作成されることがあるが、それらを取り扱うリスクを最小限に抑えるように改変されている。通常、ウイルス複製に重要なウイルスゲノムの一部が削除されている。このようなウイルスは細胞に効率的に感染することができるが、感染後に新しいビリオンを生成するためには、不足しているタンパク質を提供するヘルパーウイルスが必要になる。
  • 低毒性：ウイルスベクターは、感染する細胞の生理機能への影響を最小限にするように設計される。
  • 安定性：一部のウイルスは遺伝的に不安定であり、ゲノムが急速に変化する可能性がある。ウイルスベクターを使用して行われる作業の予測可能性と再現性に悪影響を及ぼすことから、遺伝的に安定なように設計される。
  • 細胞型の特異性：ほとんどのウイルスベクターは、可能な限り広範囲の細胞型に感染するように設計されている。しかし、宿主域が狭い方が望ましい場合もあり、特定の種類の細胞にしか感染しないようにウイルス受容体を改変することもできる。このように改変されたウイルスは、偽型（シュードタイプ）と呼ばれる。
  • 同定：ウイルスベクターには、どの細胞がウイルス遺伝子を取り込んだか判別しやすくする、マーカーと呼ばれる遺伝子を組み込むことがよくある。特定の抗生物質に対する耐性は一般的なマーカーである。ウイルスベクター遺伝子を取り込んでいない細胞は抗生物質耐性を持たず、抗生物質の存在下では増殖できないため、細胞を簡単に分離できます。

応用

基礎研究

ウイルスベクターはもともと、分子遺伝学実験のためのDNAを直接導入するトランスフェクションの代替として開発された。リン酸カルシウム沈殿などの従来の方法と比較して、ウイルスベクター による形質導入は、細胞の生存率に深刻な影響を与えることなく、ほぼ100％の細胞を確実に感染させることができる。さらに、一部のウイルスは細胞ゲノムに組み込まれ、組み込まれた遺伝子は安定して発現できる。

タンパク質をコードする遺伝子は、一般的に特定のタンパク質の機能を研究するために、ウイルスベクターを使用して発現させることができる。 GFPなどのマーカー遺伝子を安定に導入するウイルスベクター、特にレトロウイルスは、追跡したい細胞とその子孫をするために恒久的に標識するために広く使用されている。例えば、異種移植実験では、in vitroで感染した細胞を宿主動物に移植した際などに利用される。

遺伝子の挿入は、遺伝子ノックアウトよりも安価である。しかし、サイレンシングは非特異的であり、他の遺伝子にオフターゲット効果をもたらすことがあるため、信頼性が低い。動物宿主ベクターも重要な役割を果たす。

遺伝子治療

遺伝子治療は、病気の発症に関与する欠陥遺伝子を修正するための技術であり、将来的には、重症複合免疫不全症、嚢胞性線維症、血友病Aなどの遺伝性疾患を治療法となる可能性がある。これらの病気は特定の遺伝子のDNA配列の変異が起因であるため、遺伝子治療の治験ではウイルスベクターを利用して、変異していない遺伝子を患者の体細胞に導入した。遺伝子治療で多くの研究室で成功しているが、ウイルス遺伝子治療にはいくつか問題があり、広く使用される前に克服しなければならない。ウイルスに対する免疫反応は、標的細胞への遺伝子の送達を妨げるだけでなく、患者に重篤な合併症を引き起こす可能性がある。 1999年に行われた初期の遺伝子治療の治験では、アデノウイルスベクターを使用して治療されたジェシー・ゲルシンガーが死亡した[2]。

一部のウイルスベクター、たとえばガンマレトロウイルスは、宿主染色体のランダムな位置にゲノムを挿入することから、宿主細胞の遺伝子機能を妨害し、癌を引き起こす可能性がある。 2002年の重症複合免疫不全レトロウイルス遺伝子治療の治験では、4人の患者が治療により白血病を発症した[3] 。3人の患者は化学療法後に回復した[4]。アデノ随伴ウイルスベクターは、アルツハイマー病などのさまざまな病気に適用され、常にヒトゲノムの同じ部位に組み込まれるため、この点においてははるかに安全である [5]。

ワクチン

生ベクターワクチンは、人工的に弱体化したウイルスを使用し、病原体の一部を輸送して免疫応答を刺激するためのワクチンである [6]。病原体タンパク質をコードするウイルスベクターは、DNAワクチンと同じ理論的根拠により、病原体に対するワクチンとして現在開発されている。通常、病原性生物由来の表面タンパク質をコードしている抗原の遺伝子を非病原性生物のゲノムに挿入することで、非病原性生物の表面に抗原が発現され、免疫応答を誘発することがでる。

一例は、 B型肝炎ワクチンであり、 B型肝炎による感染は、酵母細胞で産生されるB型肝炎ウイルス表面抗原の形態を含む組換えワクチンの使用によって抑制される。 B型肝炎ウイルスは、ポリオウイルスなどの他の一般的なウイルスとは異なり、in vitroで増殖できないため、組換えサブユニットワクチンの開発は重要で必要とされる開発だった[7]。

Tリンパ球は、細胞内で産生された外来タンパク質により、細胞内寄生虫に感染した細胞を認識する。 T細胞免疫は、ウイルス感染やマラリアなどの病気からの保護に不可欠である。ウイルスワクチンは、 セービンポリオワクチンや他の弱毒化ワクチンと同様に、宿主細胞内で病原体タンパク質の発現を誘導する。ただし、ウイルスワクチンには病原体遺伝子のごく一部しか含まれておらず、病原体による感染が不可能なため、はるかに安全である。アデノウイルスはワクチンとして活発に開発されている。

薬の配達

猫のインターロイキン-2を運ぶように改変されたカナリア痘ウイルスの株は、線維肉腫の猫を治療するために使用されている[8]。

ウイルスベクターの種類

ガンマレトロウイルスベクター

レトロウイルスは、現在の遺伝子治療の主力である。モロニーマウス白血病ウイルスなどの組換えレトロウイルスは、安定に宿主ゲノムに組み込まれる能力を持っている。レトロウイルスはRNAゲノムからDNAを生成するための逆転写酵素と、宿主ゲノムへの組み込みを可能にするインテグラーゼを持つ。レトロウイルスベクター は、 SCID-X1試験など、FDAが承認した多くの臨床試験で使用されている[9]。

レトロウイルスベクターには、複製可能なものと複製不可能であるものがある。複製不可能なウイルスベクターの方が研究では一般的であり、ビリオンの複製とパッケージングに必須の遺伝子のコード領域が他の遺伝子に置き換えられているか、削除されているため複製する機能を欠損している。複製不可能なウイルスベクターは、標的細胞に感染して目的遺伝子を送達することができるが、細胞の溶解と細胞死につながる通常の溶解経路の継続ができないように設計されている。

複製可能なウイルスベクターは、ビリオン合成に必要なすべての遺伝子を含み、感染が発生すると増殖し続ける。複製可能ベクターのウイルスゲノムははるかに長いため、挿入可能な目的遺伝子の長さは、複製不可能ベクターに比べて短い。ウイルスベクターにもよるが、複製不可能ウイルスベクターで挿入可能な目的遺伝子の一般的な最大の長は、通常約8〜10kBである[10]。これはゲノム配列の導入には短いが、ほとんどのcDNA配列には適応可能である。

モロニーレトロウイルスなどのレトロウイルスをウイルスベクターとして使用する際の主な欠点は、形質導入のため細胞が活発に分裂している必要があることである。そのため、ニューロンなどの細胞は、レトロウイルスによる感染や形質導入に対して非常に耐性がある。

宿主ゲノムへの組み込みによる挿入型遺伝子変異は、癌や白血病につながる懸念がある。当初は理論上の懸念であったが、モロニーマウス白血病ウイルスを使用した10人のSCID-X1患者の遺伝子治療[11]において、ベクターの挿入部位により近傍のLMO2癌遺伝子が活性化され、2例の白血病がみられ現実のものとなった[12]。

レンチウイルスベクター

レンチウイルスベクターによるパッケージングと形質導入。

レンチウイルスはレトロウイルス科の一属であり、他のレトロウイルスは分裂している細胞にしか感染できないが、レンチウイルスは非分裂細胞のゲノムに感染できる特徴があり、遺伝子治療のベクターとして使用される。 ウイルスゲノムはRNAであり、ウイルスが細胞に侵入したのち逆転写によりDNAが生成され、ウイルスのインテグラーゼ酵素により宿主ゲノムに挿入される。最近の調査結果では、ウイルスDNAの挿入はランダムではなく、特定の活性遺伝子に誘導され、ゲノム構成に関連する[13] 。宿主ゲノムに挿入されたベクターはプロウイルスと呼ばれ、ゲノムに残り、分裂の際には細胞の子孫に受け継がれる。挿入位置を決定するための技術はまだないため、問題を引き起こす可能性がある。プロウイルスは、細胞の遺伝子の機能を阻害する可能性があり、癌の発生を促進する癌遺伝子の活性化につながる可能性がある。遺伝子治療におけるレンチウイルスの応用において問題となるかもしれない。しかし、いくつかの研究によると、レンチウイルスベクターは、ガンマレトロウイルスベクターよりも癌を引き起こす可能性のある場所に組み込まれにくいことが示されている[14]。より具体的には、ある研究では、レンチウイルスベクターは、腫瘍の発生率がはるかに高いマウス系統において、腫瘍発生率の増加も、腫瘍の早期発症も引き起こさなかった[15]。さらに、HIVの治療のための遺伝子治療でレンチウイルスベクターを利用した臨床試験では、変異原性または腫瘍学的事象の増加は見られなかった[16]。

安全上の理由から、レンチウイルスベクターは複製に必要な遺伝子を欠いている。レンチウイルスベクターは、いくつかのプラスミドを、いわゆるパッケージング細胞株、一般的にはHEK293にトランスフェクションすることで産生する。パッケージングプラスミドと呼ばれる1つまたは複数のプラスミドは、キャプシドや逆転写酵素などのビリオンタンパク質をコードしている。別のプラスミドには、一本鎖RNAウイルスゲノムを生成するために転写され、ベクターによって送達される目的の遺伝物質が含まれており、ゲノムをビリオンにパッケージ化するためのパッケージングシグナルであるψ （psi）配列をもつ。

アデノウイルスベクター

レンチウイルスとは対照的に、アデノウイルスDNAはゲノムに組み込まれず、細胞分裂中に複製されない。基礎研究においては利用が限定されるが、アデノウイルスベクターは依然としてin vitroおよびin vivo実験で使用されている[17]。主な用途ととして、遺伝子治療とワクチンがある。ヒトは通常、呼吸器、胃腸、眼の感染症を引き起こすアデノウイルスと接触しているため、患者の大多数は中和抗体をすでに持っており、標的細胞に到達する前にウイルスベクターが不活化されてしまう。この問題を克服するために、現在、さまざまな種に感染するアデノウイルスが科学的に調査され、人間が免疫を持たない種の探索が行われている。

アデノ随伴ウイルスベクター

アデノ随伴ウイルス（AAV）は、人間や他の霊長類に感染する小さなウイルスである。 AAVは現状、非常に軽度の免疫反応を引き起こすが、病原性はないと言われている。 AAVは分裂細胞と非分裂細胞の両方に感染可能であり、ウイルスゲノムは宿主細胞のゲノムに組み込むことも可能である。さらに、AAVは通常エピソームままであり、染色体に組み込まれることなく複製することから、長く安定して発現される[18]。これらの機能により、AAVは遺伝子治療用のウイルスベクターとして非常に魅力的な候補である[1]。ただし、AAVは最大5kbまでしか搭載できず、AAVの元の長さと比較してかなり小さい。 [19]

さらに、遺伝子治療ベクターとしての応用可能性から、自己相補的アデノ随伴ウイルス（scAAV）と呼ばれる改変されたAAVが開発されている。 AAVがパッケージ化するのは一本鎖DNAであるため、二本鎖の合成のプロセスを必要とするが、scAAVは二本鎖DNAを形成するために必要な両方の鎖をパッケージ化する。二本鎖合成をスキップすることにより、scAAVは細胞内での迅速な発現を可能にする[20]。それ以外の点については、scAAVはAAVの多くの特性を備えている。

植物ウイルスベクター

植物ウイルスは、遺伝物質を植物細胞に送達するために一般的に使用されるツールであるウイルスベクターとして利用できるが、生体材料およびナノテクノロジーデバイスとしても利用できる[21] [22]。タバコモザイクウイルス（TMV）は、最初に発見されたウイルスであり、タバコモザイクウイルスから作られたウイルスベクターとして、 magnICON®やTRBOなどがある。

ハイブリッドベクター

ハイブリッドベクターは、複数のベクターの特性を持つように遺伝子操作されたウイルスベクター である。通常ウイルスベクターは、搭載する遺伝子の長さや、免疫原性、遺伝毒性といった点や、長期的に安定したトランスジェニック発現ができないなどの欠点を持つが、ハイブリットベクターはこれらの欠点を回避するように設計される。ハイブリッドベクターは、望ましくない要素を望みどおりの能力で置き換えることにより、将来、安全性および治療効率の点で標準的なトランスフェクションベクターよりも優れた性能を発揮する可能性がある。 [23]

応用における課題

遺伝物質を細胞に送達するためのウイルスベクターの選択には、いくつかのロジスティック上の問題が伴う。治療に使用できるウイルスベクターの種類は限られており、ウイルスベクターが外来の侵入者と見なされた場合、体に免疫反応を引き起こす可能性がある[24] [25]。一度使用すると、ウイルスベクターは体に認識されるため、同じ患者に再度使用すると効果が限られる。あるワクチンや遺伝子治療が臨床試験で失敗した場合、将来、別のワクチンや遺伝子治療のウイルスベクターを同じ患者に再び使用することができない。ウイルスベクターに対する既存の免疫を持つ患者が存在する可能性があり、そういった患者でも治療が無効になる可能性がある [26]。 ワクチン接種でウイルスベクターを使用する場合、非ウイルスDNAワクチンでプライミングすることにより既存の免疫を打ち消すことは可能であるが、この方法は、ワクチン配布プロセスに追加の費用と障害を要する[27]。既存の免疫は、ワクチンの投与量を増やしたり、ワクチン接種経路を変更することで克服できる可能性がある[28]。また、ウイルスベクターのいくつかの欠点（遺伝毒性や低いトランスジェニック発現など）は、ハイブリッドベクターを使用することで克服できる可能性がある。

関連項目

  • ウイルスによる形質転換

脚注

  1. ^ a b “Construction of hybrid viruses containing SV40 and lambda phage DNA segments and their propagation in cultured monkey cells”. Cell 9 (4 PT 2): 695–705. (December 1976). doi:10.1016/0092-8674(76)90133-1. PMID 189942. 
  2. ^ Beardsley T (February 2000). “A tragic death clouds the future of an innovative treatment method”. Scientific American. http://www.sciam.com/article.cfm?colID=20&articleID=000C73D5-BB64-1C75-9B81809EC588EF21. 
  3. ^ McDowell N (15 January 2003). “New cancer case halts US gene therapy trials”. New Scientist. https://www.newscientist.com/article.ns?id=dn3271. 
  4. ^ “Efficacy of gene therapy for X-linked severe combined immunodeficiency”. The New England Journal of Medicine 363 (4): 355–64. (July 2010). doi:10.1056/NEJMoa1000164. PMC 2957288. PMID 20660403. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2957288/. 
  5. ^ “Current viral-mediated gene transfer research for treatment of Alzheimer's disease”. Biotechnology & Genetic Engineering Reviews 35 (1): 26–45. (April 2019). doi:10.1080/02648725.2018.1523521. PMID 30317930. 
  6. ^ Glossary
  7. ^ Vaccine information from Hepatitis B Foundation Archived 2011-06-28 at the Wayback Machine.
  8. ^ “EPAR summary for the public: Oncept IL-2 (Feline interleukin-2 recombinant canary pox virus) [EMA/151380/2013 EMEA/V/C/002562]”. European Medical Agency (2013年). Template:Cite webの呼び出しエラー：引数 accessdate は必須です。
  9. ^ “Gene therapy of human severe combined immunodeficiency (SCID)-X1 disease”. Science 288 (5466): 669–72. (April 2000). Bibcode: 2000Sci...288..669C. doi:10.1126/science.288.5466.669. PMID 10784449. 
  10. ^ Varmus, Harold, ed (1997). “Principles of Retroviral Vector Design”. Retroviruses. Plainview, N.Y: Cold Spring Harbor Laboratory Press. ISBN 978-0-87969-571-2. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=rv.section.4357 
  11. ^ “Sustained correction of X-linked severe combined immunodeficiency by ex vivo gene therapy”. The New England Journal of Medicine 346 (16): 1185–93. (April 2002). doi:10.1056/NEJMoa012616. PMID 11961146. 
  12. ^ “LMO2-associated clonal T cell proliferation in two patients after gene therapy for SCID-X1”. Science 302 (5644): 415–9. (October 2003). Bibcode: 2003Sci...302..415H. doi:10.1126/science.1088547. PMID 14564000. 
  13. ^ “Nuclear architecture dictates HIV-1 integration site selection”. Nature 521 (7551): 227–31. (May 2015). Bibcode: 2015Natur.521..227M. doi:10.1038/nature14226. PMID 25731161. 
  14. ^ “Hot spots of retroviral integration in human CD34+ hematopoietic cells”. Blood 110 (6): 1770–8. (September 2007). doi:10.1182/blood-2007-01-068759. PMID 17507662. 
  15. ^ “Hematopoietic stem cell gene transfer in a tumor-prone mouse model uncovers low genotoxicity of lentiviral vector integration”. Nature Biotechnology 24 (6): 687–96. (June 2006). doi:10.1038/nbt1216. PMID 16732270. 
  16. ^ “Multiple Integrated Non-clinical Studies Predict the Safety of Lentivirus-Mediated Gene Therapy for β-Thalassemia” (英語). Molecular Therapy. Methods & Clinical Development 11: 9–28. (December 2018). doi:10.1016/j.omtm.2018.09.001. PMC 6178212. PMID 30320151. https://www.cell.com/molecular-therapy-family/methods/abstract/S2329-0501(18)30090-1. 
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  18. ^ Nussbaum, Robert L; McInnes, Roderick R; Willard, Huntington F (2015). Thompson & Thompson Genetics in Medicine. Canada: ELSEVIER. p. 278. ISBN 978-1-4377-0696-3 
  19. ^ “CRISPR-Mediated Integration of Large Gene Cassettes Using AAV Donor Vectors”. Cell Reports 20 (3): 750–756. (July 2017). doi:10.1016/j.celrep.2017.06.064. PMC 5568673. PMID 28723575. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5568673/. 
  20. ^ “Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis”. Gene Therapy 8 (16): 1248–54. (August 2001). doi:10.1038/sj.gt.3301514. PMID 11509958. 
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